益气除痰法通过caspase-4途径抗癌及中西医联合治疗晚期NSCLC miRNA表达谱初步研究

【摘要】目的：在前期研究的基础上对益气除痰法代表方通过caspase-4途径发挥抗癌作用机制进行研究；对中西医联合治疗晚期非小细胞肺癌差异血清miRNA表达谱进行初步研究,并对差异miRNAs进行靶基因预测,探寻晚期非小细胞肺癌疗效监测和预测分子标记物,为中西医联合治疗晚期非小细胞肺癌个体化治疗及从基因水平探寻中西医联合治疗晚期NSCLC的作用机制提供参考。方法：以我科常用益气除痰法代表方(“益气除痰方”)为工具药,以人肺腺癌A549细胞为靶细胞,采用血清药理学方法,综合运用Hoechst33258荧光染色法、AnnexinV/PI双染法观察细胞凋亡；透射电镜观察细胞超微结构；采用细胞免疫组织化学法、RT-PCR、免疫印迹法,从基因、蛋白水平对内质网介导细胞凋亡的标志分子caspase-4表达进行定位、定量检测；运用免疫印迹法检测calpain-2、caspase-7、IRE1α、TRAF2蛋白的表达；采用化学抑制剂Z-LEVD-FMK和益气除痰方含药血清联合应用,AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡。选取5例接受中西医联合治疗且疗效获益的晚期非小细胞肺癌患者(治疗组)和3例晚期非小细胞肺癌初治患者(肺癌组)及3例健康体检者(对照组),采集血清标本并用Trizol法提取总RNA,运用Exiqon公司microRNAPCRARRAY芯片技术筛选检测肺癌组血清与对照组血清中差异miRNA表达谱、治疗组血清与肺癌组血清差异miRNA表达谱,进一步分析得到中西医联合治疗晚期非小细胞肺癌获益miRNA表达谱。运用mirbase、miranda、targetscan3种常用的miRNAs靶基因预测软件对上述治疗组获益miRNAs中同—miRNA的靶基因进行了交叉预测,初步建立中西医联合治疗晚期非小细胞肺癌获益miRNAs靶基因库。结果：1.益气除痰方含药血清作用A549细胞24h凋亡率达(14.08±1.41)%,48h凋亡率达(23.94±1.94)%；空白对照组24h、48h凋亡率分别为(3.52±0.44)%,(4.30±0.80)%,益气除痰方含药血清组与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；益气除痰方含药血清组24h与48h凋亡率比较亦显示统计学差异(P<0.01)。2.Hoechst33258荧光染色,镜下(×10)可见：益气除痰方含药血清组细胞核呈分叶、碎片状,染色质固缩、边缘化,呈致密的蓝白色颗粒状荧光,形成凋亡小体；随作用时间延长,凋亡越明显。空白对照组细胞膜完整,细胞核为圆形,染色质分布均匀,呈淡蓝色,凋亡不明显。3.透射电镜(×9700)结果显示,益气除痰方含药血清作用A549细胞48h后可见核周间隙加大,粗面内质网扩张,空泡形成；线粒体肿胀,嵴断裂。4.RT-PCR结果显示,随作用时间延长,益气除痰方含药血清组caspase-4mRNA表达逐渐增加,Oh、24h、48h各组间比较差异均显示统计学意义(P<0.01)；5.光镜下观察,caspase4蛋白定位于肺腺癌细胞胞质区,益气除痰方含药血清作用后caspase-4蛋白表达较空白对照组明显增强,呈现棕色～棕褐色表达；空白对照组蛋白表达较弱,呈棕黄色淡染。6.免疫印迹法检测结果示,与空白对照组比较,益气除痰方含药血清作用48hcaspase-4、calpain-2、caspase-7蛋白表达明显上升(P<0.01),IRE1α、TRAF2蛋白表达未见明显改变(P>0.05)。7.caspase-4被化学抑制剂Z-LEVD-FMK抑制后,益气除痰方含药血清作用A549细胞48h凋亡率达(15.88±1.00)%,与未抑制组比较凋亡率明显下降(P<0.01)；但与空白对照组比较仍显示统计学差异(P<0.01)。8.miRNAPCRARRAY芯片检测肺癌组血清与对照组血清,筛选出42个差异在2倍以上的miRNAs,其中上调的有29个,下调的有12个；具有统计学差异(P<0.05)的有5个,分别为has-miR-10b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-382-5p。9.miRNAPCRARRAY芯片检测治疗组血清与肺癌组血清,筛选出45个差异在2倍以上的miRNAs,结合所筛肺癌组与对照组差异miRNAs分析得到22个治疗后差异miRNAs,其中上调的有7个,下调的有15个；具有统计学差异(P<0.05)的有3个,分别为hsa-miR-21-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-382-5p。10.治疗组22个差异miRNAs运用生物信息软件进行靶基因预测。结论：1.益气除痰方可诱导肺癌细胞凋亡,且呈时间依赖性；2.益气除痰方可促进钙离子释放,增强内质网应激强度；激活calpai-2、caspase-7信号途径,促进内质网应激特异性凋亡蛋白caspase-4活化是益气除痰方发挥抗肺癌作用的机制之一；3.初步揭示了中西医联合治疗晚期非小细胞肺癌的差异miRNA表达谱,包括miR-21-5p、miR-182-5p、miR-382-5p在内的差异miRNAs有望成为中西医联合治疗晚期非小细胞肺癌疗效监测和预测分子标记物；4.中西医联合治疗可能通过双向调节特异性miRNA的表达来实现其治疗作用；研究结果为今后开展中西医联合治疗晚期NSCLC个体化治疗及从基因水平探寻中西医联合治疗晚期NSCLC的起效机制和药物作用靶点提供了参考。5.由于差异性miRNAs及靶基因数量较多,且一个miRNA分子可以调节多个编码基因,一个编码基因又可由多个不同的miRNAs分子所调节,miRNA的这种靶基因作用的特点,决定了从miRNA角度探讨中西医联合治疗晚期NSCLC调控网络的复杂性。
【作者】李元滨；
【导师】林丽珠；
【作者基本信息】广州中医药大学，中西医结合临床（专业学位），2014，博士
【关键词】益气除痰法；caspase-4；晚期NSCLC；中西医；miRNA；

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